味之素（AJINOMOTO）推出的StemFit For Differentiation是一款无动物源/人源、化学成分明确的hPSC分化补充剂，符合USP<1043>和ISO20399标准，可规避细胞治疗中动物/人源成分带来的病毒污染风险。

一、产品背景与核心优势

1.研发背景：细胞治疗中使用的动物/人源成分（如血清白蛋白、动物细胞来源重组蛋白）存在病毒污染风险，因此亟需无动物源的标准化分化体系。

2.产品定位：StemFit For Differentiation是专为人类多能干细胞（hPSC）设计的分化补充剂。

3.核心特性：严格遵循无动物源政策，不含任何动物或人源成分，化学成分完全明确。

4.合规标准：符合USP<1043>和ISO20399国际标准，适用于临床前及临床级细胞治疗产品的研发。

二、分化实验方案

该产品支持hPSC在10天内通过4种培养基分步分化为CD31+CD34+造血内皮细胞（HE）和CD43+CD45+造血祖细胞（HPC），实验验证其在1210B2和201B7两种iPSC细胞系中均能获得显著高于对照组的HPC产量，同时提供了配套的hPSC扩增培养基及分化所需细胞因子产品。

本方案可实现hPSC向造血谱系的分步分化，总周期为10天，分为造血内皮（HE）分化（d0-d3）和造血祖细胞（HPC）分化（d3-d10）两个阶段。

1. 造血内皮（HE）分化（d0-d3，共72小时）

•细胞预处理：将未融合的hiPSC用Accutase消化为单细胞，以1.0–3.0×10⁵ cells/well的密度接种于0.5 µg/cm² iMatrix-511包被的6孔板，在添加80 ng/mL bFGF和10 µM Y-27632的StemFit Basic03中培养过夜。关键注意事项：稀疏接种是防止分化过程中细胞过度生长的核心，尤其适用于长周期分化。

•分步诱导：

￮d0-d1（24h）：用IMDM/F12清洗后，加入1.5 mL/well Medium 1诱导原条（PS）形成。

￮d1-d2（24h）：用IMDM/F12清洗后，加入1.5 mL/well Medium 2继续分化。

￮d2-d3（24h）：加入1.5 mL/well Medium 3定向分化为CD31+CD34+造血内皮细胞（HE）。

2. 造血祖细胞（HPC）分化（d3-d10，共7天）

•细胞接种：将d3的HE细胞用Accutase消化为单细胞，以1.5×10⁴ cells/well的密度接种于低粘附U型96孔板（如PrimeSurface® MS-9096U），每孔加入75 µL Medium 4。

•培养与换液：在d7（HE接种后4天）向每孔补加75 µL Medium 4，继续培养3天至d10，获得CD43+CD45+造血祖细胞（HPC）。

•优化建议：若HPC活力较低，可将Medium4的基础培养基由DMEM/F12更换为IMDM。

三、实验验证结果

1.检测细胞系：1210B2和201B7两种hiPSC细胞系。

2.检测标志物：HE细胞为CD31+CD34+，HPC细胞为CD43+CD45+。

3.核心结论：与对照组相比，使用StemFit For Differentiation的实验组在两种细胞系中均获得了显著更高的HPC产量，流式细胞术结果显示实验组CD43+和CD45+细胞比例远高于对照组。

四、相关配套产品

关键问题与答案

1.问题：StemFit For Differentiation相比传统分化补充剂的核心价值是什么？其合规性如何？

答案：核心价值在于完全无动物源、化学成分明确，彻底规避了传统分化体系中动物/人源成分（如血清白蛋白）带来的病毒污染风险，这是细胞治疗产品实现临床转化的关键障碍之一。合规性方面，该产品严格遵循无动物源生产政策，符合USP<1043>和ISO20399国际标准，可直接用于临床前研究及临床级细胞制剂的制备。

2.问题：在hPSC向造血祖细胞分化的过程中，哪些操作要点直接决定实验成功率？

答案：关键操作要点包括：① iPSC预处理阶段必须稀疏接种（1.0–3.0×10⁵ cells/well于6孔板），这是防止分化过程中细胞过度生长的核心，过度生长会导致分化效率大幅下降；② 严格按照24小时的时间节点更换对应培养基（d0-d1用Medium1，d1-d2用Medium2，d2-d3用Medium3），每个阶段的诱导因子组合不同，时间偏差会影响分化方向；③ HE细胞接种时必须使用低粘附U型96孔板，以促进细胞聚集体形成，这是造血祖细胞产生的必要条件；④ 严格控制HE细胞接种密度为1.5×10⁴ cells/well，密度过高会导致细胞坏死，过低则无法形成有效聚集体。

3.问题：本实验中StemFit For Differentiation的效果如何？若获得的HPC活力低该如何优化？

答案：实验效果方面，在1210B2和201B7两种常用hiPSC细胞系中，使用StemFit For Differentiation的实验组HPC产量显著高于对照组，流式细胞术检测显示实验组CD43+和CD45+造血祖细胞的比例远高于对照组。优化方案：若获得的HPC活力较低，可将Medium4的基础培养基由DMEM/F12更换为IMDM，IMDM更适合造血细胞的培养，能有效提升HPC的存活率和增殖能力。