一、简介

日本神户大学团队2026 年最新发表于《Stem Cell Reports》的研究，首次在无饲养层、无异源成分（xeno-free/feeder-free）、化学成分明确的临床级条件下，从iPSC 定向分化出功能性 Vγ9Vδ2 型 γδT 细胞（iγδT），并在结直肠癌（CRC）细胞系、患者来源类器官（PDO）及体内异种移植模型中验证了显著抗肿瘤活性；细胞无同种异体反应，具备 “现货型” 异体通用型细胞治疗的核心潜力。

二、工艺拆解

完整分化工艺步骤（含全流程培养基体系）

全程无饲养层（feeder-free）、无异种成分（xeno-free），总周期约 39 天，分为iPSC 种子维持、造血祖细胞（HPC）诱导、T 细胞谱系定向、γδT 功能成熟四个阶段。

0. 起始 iPSC 种子维持培养（分化前准备）

包被基质：iMatrix-511 silk（人源重组层粘连蛋白 - 511 片段，xeno-free 贴壁基质）

产品推荐：（iMatrix-511 Silk 是一种重组人层粘连蛋白-511 E8 片段，由转基因蚕茧表达系统产生。层该产品的核心特点包括： 无异源性（Xeno-Free） 、无动物成分（Animal-Free） 、无饲养层（Feeder-Free） ——适合临床级细胞培养；支持单细胞传代，有利于稳定的培养扩增；可安全且高效地进行细胞培养。且有临床级别iMatrix-511MG可供选择。

基础培养基：StemFit AK02N（无血清、化学成分明确的 iPSC 维持培养基，味之素）

产品推荐：StemFit® 培养基是日本味之素（Ajinomoto）联合京都大学 iPS 细胞研究所（山中伸弥团队） 共同开发的人多能干细胞培养基，其核心特性包括：无动物源、化学成分明确（CD-AOF） 全部为重组合成组分，消除异种蛋白污染风险；适配再生医学临床前/临床级研究，是少数通过日本 PMDA 临床应用认证的 iPS 培养基之一；扩增效率高：适合再生医疗大规模细胞制备；批次差异极小，核型稳定，长期传代不易自发分化。 该系列还包含GMP 临床级版本（如 AK03N、Basic04CT GMP），已支持国内外多个临床项目申报。

操作：分化前7 天接种 γδT 来源 iPSC 细胞株（62B3/121-3），接种密度为 1×10³  细胞/ 6 孔板；常规换液维持多能性，至状态适配时启动分化（记为 d0）。

阶段1：造血祖细胞（HPC）诱导（d0 – d10，多能干细胞→造血祖细胞）

通过细胞因子阶梯诱导完成中胚层特化、造血内皮转化与造血祖细胞扩增。

d0 分化启动（中胚层诱导）

基础培养基：StemFit AK02N

添加因子：4 μM CHIR99021（Wnt 通路激活）+ 80 ng/mL BMP4 + 80 ng/mL VEGF

操作：全量换液，启动中胚层谱系定向。

d2 造血内皮特化

基础培养基：Advanced DMEM/F12 + 2 mM L - 谷氨酰胺 + 20% StemFit For Differentiation

添加因子：2 μM SB431542（TGF-β 通路抑制）+ 50 ng/mL bFGF + 50 ng/mL SCF + 80 ng/mL VEGF

操作：全量换液，诱导造血内皮细胞特化。

d4 造血祖细胞扩增

基础培养基：Advanced DMEM/F12 + 2 mM L - 谷氨酰胺 + 20% StemFit For Differentiation

添加因子：50 ng/mL IL-3 + 50 ng/mL IL-6 + 50 ng/mL FLT3L + 50 ng/mL SCF + 20 ng/mL VEGF + 10 IU/mL EPO

操作：全量换液，支持造血祖细胞增殖与成熟。

d6、d8 维持换液

基础培养基：Advanced DMEM/F12 + 2 mM L - 谷氨酰胺 + 20% StemFit For Differentiation

添加因子：50 ng/mL IL-6 + 50 ng/mL SCF + 10 IU/mL EPO

操作：全量换液，维持造血祖细胞状态。

d10 HPC 收获

操作：吹打收集悬浮及松散贴壁细胞，37℃孵育 20 min，经 100 μm→30 μm 细胞筛逐级过滤，离心重悬计数；

产出效率：每1×10³ 个起始 iPSC 可收获约 2.5×10⁶个造血祖细胞。

阶段2：T 细胞谱系定向分化（d10 – d24，造血祖细胞→T 系前体细胞）

通过固相化Notch 配体模拟胸腺微环境，在无饲养层条件下完成 T 细胞谱系定向。

培养板预处理：提前24 h 用碳酸盐缓冲液包被培养板，蛋白组成为 5 μg/mL VCAM1 + 10 μg/mL 重组人 DLL4 蛋白（核心 Notch 配体，替代饲养层细胞的胸腺模拟功能）。

基础培养基：StemSpan SFEM II（无血清造血扩增培养基）+ 10% 10× StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement（淋巴祖细胞扩增补充剂）

添加因子：30 ng/mL DKK-1 + 5 mM 壬二酸（azelaic acid）

接种密度：1.2×10⁴个 HPC/48 孔板

操作：每周2 次半量换液，持续诱导 T 谱系分化至 d24。

阶段3：γδT 细胞刺激扩增与功能成熟（d24 起，刺激≥7 天，d31 后可用于功能实验）

通过磷酸抗原特异性激活+ 细胞因子支持，完成 γδT 细胞的终末分化、扩增与效应功能武装。

基础培养基：RPMI1640 + 10 mM HEPES + 1 mM 丙酮酸钠 + 1% GlutaMax + 20% StemFit For Differentiation

刺激因子组合：100 ng/mL IL-15 + 1 mM 2 - 脱氧葡萄糖（2DG） + 1 nM HMBPP（磷酸抗原，特异性激活 Vγ9Vδ2 TCR）

操作：d24 半量换液为刺激培养基，此后每周 2 次半量换液；刺激培养≥7 天（约 d31）获得功能性成熟 iγδT 细胞，可继续维持扩增至 d39–d58 用于实验。

产品推荐：分化阶段使用了StemFit For Differentiation分化培养基，（味之素）。化学成分明确且无动物源成分（CD-AOF），批次一致性好，并已推出GMP级版本。在本工艺的阶段1（d0-d10，HPC诱导）和阶段3（d24起，γδT刺激扩增）中均有使用，配合阶梯式细胞因子组合，实现了从iPSC到功能性γδT细胞的全流程无血清、无异源成分分化。

三、功能验证：从细胞系到患者源性模型的递进证据

1. 体外细胞毒活性

血液瘤（Jurkat 细胞）：E:T=2:1 时杀伤率约 90%，4:1 时达 97%，杀伤活性不依赖唑来膦酸辅助。

结直肠癌细胞系（SW480）：E:T=2:1 时杀伤率约 83%，活性显著优于外周血来源 γδT（PBγδT 约 54%），且在 HLA 完全不匹配的异体环境下稳定起效。

2. 患者来源类器官（PDO）验证（研究核心亮点）

针对2 株临床 CRC 患者来源的类器官（Rm8、Rm19），E:T=10:1 时体外杀伤率分别达 74% 和 94%。

专家视角：这是首次证实iPSC 来源 T 细胞对肿瘤类器官有效。相比传统细胞系，PDO 保留了原发肿瘤的异质性与药物敏感性特征，证据等级更接近临床真实疗效，直接拉近了基础研究与临床转化的距离。

3. 体内抗肿瘤活性

覆盖局部控制与系统给药两大临床场景：

局部共注射：在Jurkat、SW480、CRC 类器官模型中，肿瘤生长抑制率 70%\100%，肿瘤重量下降 80%\97%；免疫组化证实 iγδT 细胞定位于肿瘤周边。

静脉系统给药：

同时给药（模拟术后辅助治疗）：4 周肿瘤发光信号下降 53%\97%，肿瘤重量下降 25%\88%；

成瘤后给药（模拟晚期/ 复发治疗）：3 次给药后肿瘤重量下降 43%\92%，发光信号下降 67%\78%。

专家视角：静脉给药有效证实了细胞的体内归巢与实体瘤浸润能力，是系统治疗的核心前提；两个给药场景分别对应术后辅助与晚期治疗，临床转化路径清晰。

四、安全性：异体通用型的核心优势

与HLA 完全不匹配的健康人 PBMC 共培养，iγδT 几乎不杀伤正常单个核细胞，死亡率与空白组无统计学差异，无同种异体反应、无 GVHD 风险。

专家视角：这是γδT 对比异体 αβ T 细胞的核心壁垒 —— 无需基因编辑敲除 TCR 即可实现异体通用，大幅简化工艺、降低成本与基因编辑安全风险，是 “现货型” 免疫细胞治疗的最优载体之一。

五、机制与应用前景

1. 杀伤机制

初步阻断实验提示，iγδT 的杀伤主要依赖 Fas/FasL 通路，γδTCR 与 NKG2D 通路贡献有限；结合其先天样、终末效应表型，说明其杀伤为 “预武装” 的天然免疫模式，广谱性强，但也提示可通过 CAR 修饰进一步提升肿瘤靶向性。

2. 产业与临床价值

解决行业痛点：突破自体外周血γδT 扩增有限、批次差异大、制备周期长的瓶颈，iPSC 来源可实现标准化、规模化量产，大幅降低治疗成本。

实体瘤治疗新路径：结直肠癌是全球高发实体瘤，现有CAR-T 疗效有限；iγδT 兼具肿瘤浸润能力与 MHC 非限制性杀伤，可作为实体瘤免疫治疗的通用型平台，未来可叠加 CAR、细胞因子修饰等 “装甲” 策略升级。

工艺可转化性强：无饲养无血清体系可直接向GMP 工艺平移，为 IND 申报扫清了核心工艺障碍。

六、局限性与待优化方向

临床前样本量有限：仅验证2 例 CRC 类器官，结直肠癌异质性高，需更多不同分型、分期的患者样本验证广谱性。

工艺纯度仍有提升空间：表面CD3 阳性率约 70%，可通过优化分化时序与分选策略进一步提升终产品纯度。

免疫微环境未充分验证：体内实验采用免疫缺陷鼠，未评估实体瘤免疫抑制微环境对细胞功能的影响，以及T 细胞耗竭、体内存续时间等长期问题。

机制研究较浅：FasL 通路仅为初步结论，详细杀伤机制、肿瘤识别谱仍需深入解析。

Reference

Futai R, Koyanagi-Aoi M, Nakahashi A, Katsura D, Horikawa M, Horie K, Kakeji Y, Kodama Y, Aoi T. Allogeneic iPSC-derived γδT cells demonstrate antitumor efficacy against patient-derived tissues. Stem Cell Reports. 2026 Jul 23:103018. doi: 10.1016/j.stemcr.2026.103018